豆科植物在世界范圍內(nèi)普遍種植，廣泛應(yīng)用于食 品、化妝品和制藥等領(lǐng)域，但由于加工不當(dāng)，常引發(fā) 中毒類型的食源性突發(fā)公共衛(wèi)生事件 。 豆科植 物中主要含植物凝集素和皂苷 2 種毒性物質(zhì)，含有的 蛋白酶抑制劑、脂肪氧化酶和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)也會(huì) 促進(jìn)中毒發(fā)生或者加重中毒癥狀。目前對(duì)豆科植 物食源性中毒診斷的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)尚無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)，本研究選擇常見(jiàn)豆類蔬菜——豆角，對(duì)其所含皂 苷和紅細(xì)胞凝集素的毒性、溶血性和紅細(xì)胞凝集性進(jìn) 行了試驗(yàn)研究，為豆科植物食物中毒的實(shí)驗(yàn)室診斷提 供方法與評(píng)價(jià)依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

SPF 級(jí) SD 大鼠，體重 180～220 g， 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許 可證號(hào)：SCXK- （京） 2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度 20～25 ℃，相對(duì)濕度 40%～ 70%，合格證號(hào)：SYXK （津） 2014-0001。

熒光倒置顯微鏡 （日本奧林巴斯），ario Skan Flash 光柵型多功能酶標(biāo)儀 （美國(guó) Threom） ， Centrifuge 5810 高速離心機(jī)（德 國(guó) Eppendorf），GNP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），多功能果蔬料理機(jī)，皂苷快速定性試劑盒，48 孔聚苯乙烯血凝 板，新鮮兔血、雞血。

平行稱取 50 g 豆角 4 份，150 g 豆角 4 份，分別于沸水中煮沸 0、3、5、10 min，冰 盒降溫，吸去表面水分，果蔬料理機(jī)制成勻漿，并加 入生理鹽水 30 mL，為不同煮沸時(shí)長(zhǎng)Ⅰ號(hào)勻漿和Ⅱ號(hào) 勻漿。平行稱取 150 g 豆角 4 份，同法制成勻漿，4 層紗布過(guò)濾，并加入生理鹽水 30 mL，為不同煮沸時(shí) 長(zhǎng)Ⅲ號(hào)濾液。

參照 GB 15193.3—2014 《急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》，人用量按 200 g/60 kgbw 計(jì) 算。大鼠隨機(jī)分為 8 組，每組 10 只，雌雄各半，狀 態(tài)良好，同性別大鼠個(gè)體間體重差異不超過(guò) 15%。 大鼠經(jīng)口灌胃 0、3、10 min 組Ⅰ號(hào)勻漿，劑量分別 為 20.0 g/kgbw （記為低劑量組，相當(dāng)于人用量的 6 倍 ， 灌 胃 量 為 36、 30、 29 mL/kg） 和 40.0 g/kgbw （記為中劑量組，相當(dāng)于人用量的 12 倍，灌胃量為 71、60、56 mL/kg）；經(jīng)口灌胃 0、3 min 組Ⅲ號(hào)濾 液，劑量為 75.0 g/kgbw （記為高劑量組，相當(dāng)于人 用量的 22 倍，灌胃量為 73、63 mL/kg；受試物 5 h 內(nèi)分 2～3 次給予，觀察 2 周內(nèi)大鼠中毒癥狀和死亡情況。

取煮沸 0、3、5、10 min 的Ⅰ號(hào)勻漿和Ⅲ號(hào)濾液，采用皂苷快速定性試劑盒法 檢測(cè)皂苷含量，若比色管出現(xiàn)淡黃色至磚紅色可判斷 為皂苷陽(yáng)性，顏色越深表明皂苷含量越高。陰性對(duì)照 為生理鹽水。

新鮮兔血脫纖維抗凝，配成 2%兔紅細(xì)胞混懸液。取 ４ 種不同煮沸時(shí)長(zhǎng)的Ⅱ號(hào)勻 漿和Ⅲ號(hào)濾液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝板 為第 1 孔，從第 2 孔起用生理鹽水倍比稀釋，然后每 孔加入等量 0.5 mL 2%兔紅細(xì)胞懸液，混勻，每個(gè)濃 度做 2 個(gè)平行孔，并設(shè)陰性對(duì)照 （生理鹽水 + 2%兔 紅細(xì)胞懸液） 和陽(yáng)性對(duì)照 （蒸餾水+2%兔紅細(xì)胞懸 液）。于 37 ℃恒溫孵箱中靜置，每隔 0.5 h 觀察紅細(xì) 胞溶解情況，觀察 4 h。4 h 后，1 500 r/min 離心 10 min，取上清液，575 nm 處測(cè)定吸光度 （OD），計(jì) 算溶血率。溶 血 率 （%） = ［（ODt-ODn ）c / （ODpcODn ）c ］ ×100%。式中，ODt 為試驗(yàn)管吸光度，ODnc 為陰性對(duì)照管吸光度，ODpc 為陽(yáng)性對(duì)照管吸光度。溶 血率＞5%為溶血。

新鮮雞血脫纖維抗凝，配 成 1%雞紅細(xì)胞混懸液。取 4 種不同煮沸時(shí)長(zhǎng)的Ⅱ號(hào) 勻漿和Ⅲ號(hào)濾液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝 板為第 1 孔，從第 2 孔起用生理鹽水倍比稀釋，然后 每孔加入等量 0.5 mL 1%雞紅細(xì)胞懸液，混勻，每個(gè) 濃度做 2 個(gè)平行孔，并設(shè)陰性對(duì)照 （生理鹽水 +1% 雞紅細(xì)胞懸液）。37 ℃恒溫孵箱中靜置，每隔 0.5 h 觀察紅細(xì)胞凝集情況，觀察 4 h。4 h 后取出，若溶 液有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明 有紅細(xì)胞凝集發(fā)生，并進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝 聚：將凝聚物放在載玻片上，在蓋玻片邊緣滴加生理 鹽水，顯微鏡下觀察，凝集紅細(xì)胞能被沖散者為假凝 聚，記為“-”；否則為真凝聚，記為“+”。

采用 SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，率的 組間比較采用 Fisher 確切概率法，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 受試物大鼠體內(nèi)毒性試驗(yàn)結(jié)果 低、中劑量組 大鼠灌胃后約 0.5 h 出現(xiàn)趴臥 （染毒后臨床癥狀）， 分別在 6 h 和 24 h 后基本恢復(fù)正常；高劑量組大鼠 灌胃后約 0.5 h 出現(xiàn)趴臥，24 h 后基本恢復(fù)正常。觀 察期內(nèi)大鼠體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，大體解剖主要臟器未見(jiàn) 異常，無(wú)死亡個(gè)體。不同處理時(shí)間不同劑量組大鼠出 現(xiàn)趴臥癥狀的比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。
 

2.2.1 皂苷快速定性試劑盒法 0、3、5 min 組Ⅰ號(hào) 勻漿和Ⅲ號(hào)濾液比色后均出現(xiàn)淡黃色至棕紅色變化， 為皂苷陽(yáng)性，顏色隨著煮沸時(shí)間的增加而變淡； 10 min 組Ⅰ號(hào)勻漿和Ⅲ號(hào)濾液均不顯色。

2.2.2 溶血性試驗(yàn)結(jié)果 陰性對(duì)照組溶血率為 0，陽(yáng) 性對(duì)照組溶血率為 100.00%。Ⅱ號(hào)勻漿 0、3、5、 10 min 組原液和 0、3、5 min 組 1∶2 稀釋液的溶血 率均＞5%，溶血性試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性；Ⅲ號(hào)濾液 0、3、 5、10 min 組原液、1∶2 稀釋液，3、5 min 組 1∶4、 1∶8 稀釋液以及 3 min 組 1∶16 稀釋液的溶血率均＞ 5%，溶血性試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。見(jiàn)表 2。

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，新鮮豆角的大鼠急性經(jīng)口毒性為 實(shí)際無(wú)毒 。NCIRI 等  研究發(fā)現(xiàn)，用未加工的 菜豆干豆粉 （Beldia，bean） 制成混懸液，經(jīng)口灌胃 Wistar 大鼠，300 mg 連續(xù) 10 天，未見(jiàn)大鼠出現(xiàn)明顯 的臨床中毒癥狀或死亡。

本試驗(yàn)采用改良溶血試驗(yàn)評(píng)價(jià)豆角樣品的溶血 性，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀比色，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，對(duì)采 樣量的要求更為靈活；紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)采用熒光倒置 顯微鏡觀察，使結(jié)果判斷更為直觀準(zhǔn)確。皂苷快速檢 測(cè)、改良溶血試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)法聯(lián)合使用可初步判斷豆科植物食源性中毒。今后研究應(yīng)對(duì)皂苷和凝 集素進(jìn)行提純，以便提高檢出率，消除干擾因素，同 時(shí)應(yīng)考慮酸堿度 （pH 值）、溫度和提取方法等對(duì)皂苷 和凝集素活性的影響，使這 2 種物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)更加 可靠。