哈蟆油( Oviductus Ｒanae) 系蛙科動(dòng)物中國林蛙( Ｒana temporaria chensinensis David． ) 雌蛙的輸卵管干制 品，純天然、無污染、全營養(yǎng)，已然成為中國東北的珍貴滋補(bǔ)品。哈蟆油的食用歷史可追溯到滿族入關(guān) 之前，只有在滿族大祀或大宴等重要活動(dòng)時(shí)，哈蟆油才會(huì)作為最圣潔的食品出庖供盤。而在民間，哈蟆油有多 種加工方法，比如蒸、燉、烘干等，這些加工方法對(duì)哈蟆油中主要活性成分的影響尚不明確。因此，本文以 2015 版《中華人民共和國藥典》一部中哈蟆油的鑒別指標(biāo)———1 － 甲基海因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過 HPLC 法建 立含量測(cè)定方法，并對(duì)不同哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因的含量進(jìn)行比較，為哈蟆油加工方法的深入研究奠 定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1． 1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀、Chemstation 工作站( 美國安捷倫科技有限公司) ;昆山舒美KQ-250 型超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公司) ; FA1004B 型電子天平( 上海佑科儀器儀表有限公司) ; AB135 － S 型電子分析天平 ( 梅特勒 － 托利多國際股份有限公司) ; 上海精宏DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) 。 哈蟆油( 吉林省鼎源特產(chǎn)經(jīng)貿(mào)有限公司，批號(hào): 20170801) ，經(jīng)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室肖井雷 副教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》2015 版一部項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定; 1 － 甲基海因( 中國藥品生物制品 檢定所，批號(hào): 111836 － 201102) 。

1． 2 實(shí)驗(yàn)方法

1． 2． 1 哈蟆油加工品的加工方法

不同哈蟆油加工品的加工方法見表 1。

1． 2． 2 色譜條件

色譜柱為 AlltimaTM C18 柱( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相為純凈水，進(jìn)樣量為 10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為 215 nm。

1． 2． 3 溶液配制

1． 2． 3． 1 對(duì)照品溶液

取 1 － 甲基海因?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加甲醇制成 1 mL 含 0． 102 mg 的溶液，作為 1 － 甲基海因?qū)φ掌?母液; 精密吸取 1 － 甲基海因?qū)φ掌纺敢?1 mL，置 10 mL 量瓶中，制成 1mL 含 10． 2 μg 的溶液，即得。

1． 2． 3． 2 供試品溶液

取清炒、焦炒、水煮、清蒸、烘干及未加工的哈蟆油適量，粉碎，稱取約 5 g，加入 8 倍量甲醇超聲提取 30 min( 功率 250 W，頻率 40 kHz) ，過濾，同法提取 3 次，收集、合并濾液; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，轉(zhuǎn)移至 5 mL 量瓶中， 加甲醇定容至刻度，即得。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2． 1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、清炒哈蟆油供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖 1 和圖 2，待測(cè)色譜 峰與相鄰色譜峰基本分離，理論塔板數(shù)按 1 － 甲基海因峰計(jì)算均不低于 3 000。

2． 2 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取上述配制好的 1 － 甲基海因?qū)φ掌纺敢?0． 2、0． 4、1． 0、2． 0、4． 0 mL 分別置 10 mL 量瓶中，加甲 醇稀釋定容到刻度，搖勻，使質(zhì)量濃度分別為 2． 04、4． 08、10． 20、20． 40、40． 80、102 μg /mL。將 6 種溶液分別 注入高效液相色譜儀中，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線( 圖 3) ，得回歸方程 y = 42． 195x + 0． 087 3 ( Ｒ2 = 0． 999 6) ，結(jié)果表明，1 － 甲基海因質(zhì)量濃度在 2． 04 ～ 102 μg /mL 范圍線性關(guān)系良好。





3 討論

3． 1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本文采用二極管陣列( DAD) 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到 1 － 甲基海因在 215 nm 有較大的吸收峰，且與 鄰近色譜峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，故選擇在該波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

3． 2 流動(dòng)相體系的選擇

預(yù)先選擇了甲醇、甲醇 － 水、甲醇 － 0． 1% 磷酸、乙腈 － 水、乙腈 － 0． 1% 磷酸和水 6 種 流動(dòng)相體系進(jìn)行比較，考慮到待測(cè)色譜峰與相鄰色譜峰的分離情況及峰形效果，故選擇 100% 水作為流 動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

3． 3 供試品制備方法的選擇

本文分別比較了不同提取方法( 超聲提取法、回流提取法和浸漬法) 、不同提取溶劑( 甲醇、無水乙醇、乙 酸乙酯、水) 和不同提取時(shí)間( 15 min、30 min、45 min、60 min) 對(duì)哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因提取率的影響， 發(fā)現(xiàn)采用甲醇超聲提取 30 min 時(shí)，1 － 甲基海因提取較完全，且不隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，故選擇此條件 處理供試品。

3． 4 含量測(cè)定結(jié)果分析

本文通過對(duì)哈蟆油 5 種不同加工品中相關(guān)活性成分 1 － 甲基海因的含量進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn) 100℃ 烘干 4 h 與未加工哈蟆油樣品中 1 － 甲基海因的含量差別較小，水煮和清蒸的加工方法使 1 － 甲基海因的含量略有下 降，清炒和炒焦的加工方法使 1 － 甲基海因的含量明顯地下降，且隨著炒制時(shí)間的增加，1 － 甲基海因的含量 隨之驟降，這些因素都可能影響哈蟆油的相關(guān)藥效作用。

4 結(jié)論

本文建立的 HPLC 測(cè)定不同哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因含量的方法操作簡(jiǎn)單、便捷、重復(fù)性良好。考慮到哈蟆油不同的加工方法還會(huì)影響到微生物活性、水溶性蛋白含量等方面，因此仍需對(duì)加工方法進(jìn)行進(jìn)一 步推敲，以確保達(dá)到哈蟆油藥效的最佳發(fā)揮。



 

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